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SARS-CoV2_ARTIC_Illumina新冠病毒分型和突变分析

  • 发布于 2023-04-06
  • 分类：云计算
  • 阅读(2250)

SARS-CoV2_ARTIC_Illumina新冠病毒分型和突变分析

一. 本文适用于使用Artic扩增子扩增，Illumina双端测序，用于分析新冠病毒突变及分型鉴定

二. 概览：按照惯例，先上一张概览图

流程输入

SRR22216743_1.fastq.gz SRR22216743_2.fastq.gz

测试数据下载
NYC SARS-CoV-2 genome sequencing from human nasopharyngeal swabs**
1 ILLUMINA (Illumina HiSeq 2000) run: 28,721 spots, 5.8M bases, 1.8Mb downloads
使用NCBI官方工具sra-toolkit拆分成fastq.gz文件 fastq-dump SRR22216743 --split-3 --gzip
得到SRR22216743_1.fastq.gz SRR22216743_2.fastq.gz

参考文件，默认路径/opt/ref下
Artic-ncov2019
artic-ncov2019 primer&参考序列

GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff GFF文件

分析流程文件（可一键导入sliverworkspace运行）及报告文件，conda环境文件下载，导入操作

运行环境

docker image based on ubuntu21.04 Conda Mamba（默认使用清华源） ssh

分析软件

- fastp=0.23.2
- fastqc=0.11.9
- multiqc=1.13
- bwa=0.7.17
- minimap2=2.24
- samtools=1.16.1
- ivar=1.3.1
- quast=5.2.0
- pangolin=4.1.3

输出结果

multiqc_report.html 测序数据trim前后质量数据
SRR22216743.samcov.tsv reads数量，覆盖度，测序深度，baseQ mapQ
quast输出分析结果：alignment_viewer.html contig_size_viewer.html （拼接序列情况）report.html
按照序列一致性组装的新冠病毒序列 SRR22216743.consensus.fa
Panglin 根据组装的序列分析得出病毒分型信息 lineage_report.csv
samtools,ivar 根据primertrim.bam获的新冠病毒突变信息，过滤后得到 SRR22216743_variantsfiltered.tsv

环境搭建: 为了快速完成环境搭建，节省95%以上时间。

本文使用docker + conda (mamba) 作为基础分析环境，镜像获取：docker/docker-compoes 的安装及镜像构建见《基于docker的生信基础环境镜像构建》,docker镜像基于ubuntu21.04构建，并安装有conda/mamba，ssh服务。并尝试初次运行时初始化安装所需软件下载所需文件（作为代价首次运行时间会较长，切需网络通畅），即实现自动初始化的分析流程。

备注：docker运行的操作系统，推荐为Linux，windows，macOS系统改下docker可能部分功能（网络）不能正常运行

<code style="margin-left:0"> # 拉取docker镜像
 docker     pull     doujiangbaozi/sliverworkspace:latest
 ​
 # 查看docker 镜像
 docker     images</code>

基础环境配置，docker-compose.yml 配置文件，可以根据需要自行修改调整

<code style="margin-left:0"> version: "3"
 services:
   SarsCov2:
     image: doujiangbaozi/sliverworkspace:latest
     container_name: SarsCov2
     volumes:
       - /media/sliver/Data/data:/opt/data:rw                               #挂载原始数据，放SC2目录下
       - /media/sliver/Manufacture/SC2/envs:/root/mambaforge-pypy3/envs:rw  #挂载envs conda环境目录
       - /media/sliver/Manufacture/SC2/config:/opt/config:rw                #挂载config conda配置文件目录
       - /media/sliver/Manufacture/SC2/ref:/opt/ref:rw                      #挂载reference目录
       - /media/sliver/Manufacture/SC2/result:/opt/result:rw                #挂载中间文件和输出结果目录
     ports:
       - "9024:9024"                                                        #ssh连接端口可以按需修改
     environment:
       - TZ=Asia/Shanghai                                                   #设置时区
       - PS=20191124                                                        #修改默认ssh密码
 ​</code>

基础环境运行

<code style="margin-left:0"> # docker-compose.yml 所在目录下运行
 docker-compose up -d
 ​
 # 或者 
 docker-compose up -d -f /路径/docker-compose.yaml
 ​
 # 查看docker是否正常运行,docker-compose.yaml目录下运行
 docker-compose ps
 ​
 # 或者
 docker ps</code>

docker 容器使用，类似于登录远程服务器

<code style="margin-left:0"> # 登录docker，使用的是ssh服务，可以本地或者远程部署使用
 ssh root@192.168.6.6 -p9024
 ​
 # 看到如下，显示如下提示即正常登录
 (base) root@SliverWorkstation:~# </code>

三. 分析流程

1. 变量设置

<code style="margin-left:0"> #样本编号
 export sn=SRR22216743
 #数据输入目录
 export data=/opt/data
 #数据输出、中间文件目录
 export result=/opt/result
 #conda安装的环境目录
 export envs=/root/mambaforge-pypy3/envs 
 #artic primer 版本V1,V2,V3,V4,V4.1
 export artic_primer_version=4.1
 #设置可用线程数
 export threads=8</code>

2. 分析前QC，看下数据质量

<code style="margin-left:0"> #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
 if [ ! -d "${envs}/qc" ]; then
   mamba env create -f /opt/config/qc.yaml
 fi
 ​
 conda activate qc
 ​
 mkdir -p ${result}/${sn}/clean mkdir -p ${result}/${sn}/qc
 ​
 fastqc ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz -o ${result}/${sn}/qc
 ​
 fastp -i ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz -I ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz \
   -o ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz -O ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \
   -h ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.html -j ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.json 
 ​
 fastqc ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \
   -o ${result}/${sn}/qc
 ​
 #汇总一下之前结果，得到一个总体报告
 multiqc ${result}/${sn}/qc/ -f -o ${result}/${sn}/qc
 ​
 conda activate</code>

3. 比对到参考基因组上，得到bam文件并排序

<code style="margin-left:0"> mkdir -p ${result}/${sn}/aligned
 ​
 if  [ ! -d "/opt/ref/artic-ncov2019" ]; then
     apt-get install -y git
     git clone https://github.com/artic-network/artic-ncov2019.git "/opt/ref/artic-ncov2019"
 fi
 ​
 #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
 if [ ! -d "${envs}/SC2" ]; then
   mamba env create -f /opt/config/SC2.yaml
 fi
 ​
 conda activate SC2
 ​
 #如果没有索引，创建索引
 if  [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta.amb ] ||
     [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta.ann ] ||
     [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta.bwt ] ||
     [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta.pac ] ||
     [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta.sa ]; then
     if [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta ]; then
         cp  -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/SARS-CoV-2.reference.fasta \
             /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta
     fi
     bwa index /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta
 fi
 ​
 bwa mem -t ${threads} \
   /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta \
   ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz | \
   samtools sort | samtools view -F 4 -o ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam
 ​
 samtools index ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam
 mv  ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam.bai ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bai
 conda deactivate</code>

4. 去除artic primer （primer trim）

<code style="margin-left:0"> conda activate SC2
 ​
 if  [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/ARTIC-${artic_primer_version}.bed ]; then
   if [ ! -f /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.scheme.bed ]; then
     cp  -r /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/SARS-CoV-2.scheme.bed \
         /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.scheme.bed
   fi
   perl -ne 'my @x=split m/\t/; print join("\t",@x[0..3], 60, $x[3]=~m/LEFT/?"+":"-"),"\n";' \
     < /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.scheme.bed  \
     > /opt/ref/artic-ncov2019/ARTIC-${artic_primer_version}.bed
 fi
 ​
 ivar trim -e -i ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam \
   -b /opt/ref/artic-ncov2019/ARTIC-${artic_primer_version}.bed \
   -p ${result}/${sn}/aligned/${sn}.primertrim
   
 conda deactivate</code>

5. primer trim 排序

<code style="margin-left:0"> conda activate SC2
 ​
 samtools sort ${result}/${sn}/aligned/${sn}.primertrim.bam \
   -o ${result}/${sn}/aligned/${sn}.primertrim.sorted.bam
   
 conda deactivate</code>

6. 获取拼接后一致性序列

<code style="margin-left:0"> conda activate SC2
 ​
 samtools mpileup -A -d 1000 -B -Q 0 \
   --reference /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta \
   ${result}/${sn}/aligned/${sn}.primertrim.sorted.bam | ivar consensus -p ${result}/${sn}/${sn}.consensus -n N -i ${sn}
 ​
 grep -v ">" ${result}/${sn}/${sn}.consensus.fa | grep -o -E "C|A|T|G" | wc -l
 ​
 conda deactivate</code>

7. 使用Pangolin获取序列分型信息

<code style="margin-left:0"> #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
 if [ ! -d "${envs}/pangolin" ]; then
   mamba env create -f /opt/config/pangolin.yaml
 fi
 ​
 conda activate pangolin
 ​
 pangolin ${result}/${sn}/${sn}.consensus.fa --outdir ${result}/${sn} 
 ​
 conda deactivate</code>

8. 获取突变信息

<code style="margin-left:0"> conda activate SC2
 ​
 if [ ! -f "/opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff" ]; then
   aria2c https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/009/858/895/GCF_009858895.2_ASM985889v3/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff.gz -d /opt/ref
   gzip -f  -d /opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff.gz
 fi
 ​
 samtools mpileup -aa -A -d 0 -B -Q 0 \
   --reference /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta \
   ${result}/${sn}/aligned/${sn}.primertrim.sorted.bam | \
   ivar variants -p ${result}/${sn}/${sn}_variants -q 30 -t 0.01 -m 0 \
   -r /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta \
   -g /opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff
 ​
 ivar filtervariants -p ${result}/${sn}/${sn}_variantsfiltered ${result}/${sn}/${sn}_variants.tsv
   
 conda deactivate</code>

9. 获取quast报告及bam覆盖度、测序深度、baseQ、mapQ等质控信息

<code style="margin-left:0"> conda activate SC2
 ​
 if [ ! -f "/opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff" ]; then
   aria2c https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/009/858/895/GCF_009858895.2_ASM985889v3/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff.gz -d /opt/ref
   gzip -f  -d /opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff.gz
 fi
 ​
 quast ${result}/${sn}/${sn}.consensus.fa \
   -r /opt/ref/artic-ncov2019/primer_schemes/nCoV-2019/${artic_primer_version}/nCoV-2019.reference.fasta \
   --features /opt/ref/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.gff \
   --ref-bam  ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam \
   --output-dir ${result}/${sn}/quast
 ​
 samtools coverage ${result}/${sn}/aligned/${sn}.sorted.bam -o ${result}/${sn}/aligned/${sn}.samcov.tsv
 ​
 conda deactivate</code>

10. 报告(可选)

11. 使用IGV Browser查看突变信息（可选）

四. 参考链接

https://github.com/artic-network/artic-ncov2019

https://github.com/CDCgov/SARS-CoV-2_Sequencing/tree/master/protocols/BFX-UT_ARTIC_Illumina

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